甘蔗内生固氮菌的分离鉴定及16SrRNA基因克隆和序列分析

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本文首先用无氮培养基从福州甘蔗栽培品种的根部进行内生固氮菌的分离、纯化和筛选,并采用乙炔还原法对这些菌株进行固氮酶活性测定;其次对分离出的菌株进行生理生化指标测定和16S rRNA基因克隆和序列分析;同时研究了在不同环境因子作用下少动鞘氨醇单胞菌的生长特性;最后,采用三亲交配法将nifH-gfp融合荧光蛋白标记基因导入固氮菌少动鞘氨醇单胞菌,将其回接到甘蔗中,利用激光共聚焦扫描显微镜对其进行了观察。研究结果表明:实验分离到了12株形态大小、质地各异的菌株;固氮酶活性测定结果显示6株固氮酶活性较高,其中少动鞘氨醇单胞菌固氮酶活性为最高;在对12株菌16S rRNA基因的序列分析的基础上,建立了系统发育树,确定了菌株分类学地位及进化亲缘关系;在不同环境因子作用下,少动鞘氨醇单胞菌在生长时对这些处理有较广的适应性,对温度和pH的适应范围较大,在15-40℃,pH4.5-9.0范围内均能生长,并且具有很强的耐铵能力,而且对高渗透压环境也有很强的适应性;显微观察表明固氮菌主要定殖在甘蔗根的内皮层细胞,回接结果显示接种少动鞘氨醇单胞菌的甘蔗苗与未接菌的对照相比,株高提高了87.19%,鲜重增加了119.88%。
摘要第2-3页
Abstract第3页
中文文摘第4-6页
目录第6-9页
绪论第9-15页
    一、生物固氮的意义第9页
    二、内生固氮菌第9-10页
    三、甘蔗内生固氮菌研究进展第10-12页
    四、甘蔗内生固氮菌研究存在问题与展望第12页
    五、本课题的研究意义与研究内容第12-15页
第1章 甘蔗内生固氮菌分离纯化和初步鉴定第15-25页
    1.1 实验材料第15-16页
        1.1.1 材料第15页
        1.1.2 培养基第15-16页
        1.1.3 实验试剂第16页
        1.1.4 主要仪器第16页
    1.2 方法与步骤第16-18页
        1.2.1 固氮细菌的分离纯化第16页
        1.2.2 固氮酶活性的测定第16-17页
        1.2.3 固氮菌的生理生化特性第17-18页
        1.2.4 固氮菌的初步鉴定与保存第18页
    1.3 结果与讨论第18-22页
        1.3.1 固氮细菌的分离纯化筛选第18-19页
        1.3.2 固氮菌酶活检测结果第19-20页
        1.3.3 固氮菌的初步鉴定第20-21页
        1.3.4 菌种生理生化初步鉴定结果第21-22页
    1.4 本章小结第22-25页
第2章 固氮菌16S rRNA基因克隆及系统发育分析第25-33页
    2.1 实验材料第25-26页
        2.1.1 菌株第25页
        2.1.2 主要工具酶和试剂第25页
        2.1.3 主要仪器第25页
        2.1.4 溶液配制(主要参考分子克隆实验指南第三版)第25-26页
    2.2 方法与步骤第26-28页
        2.2.1 细菌基因组 DNA的提取第26页
        2.2.2 16Sr RNA基因的PCR扩增第26-27页
        2.2.3 目的基因片段的回收与序列测定第27-28页
        2.2.4 系统发育树的构建第28页
    2.3 结果与讨论第28-31页
        2.3.1 16S rRNA基因的PCR扩增结果第28-29页
        2.3.2 16S rRNA序列同源性分析第29页
        2.3.3 16SrRNA序列的系统发育分析第29-31页
    2.4 本章小结第31-33页
第3章 影响固氮菌生长的环境因子效应试验第33-39页
    3.1 实验材料第33页
        3.1.1 菌株第33页
        3.1.2 培养基第33页
        3.1.3 实验试剂第33页
        3.1.4 主要仪器第33页
    3.2 方法与步骤第33-34页
        3.2.1 固氮菌株生长曲线测定第33页
        3.2.2 不同温度对菌株生长的影响第33页
        3.2.3 不同pH对菌株生长的影响第33-34页
        3.2.4 不同渗透压对菌株生长的影响第34页
        3.2.5 不同蔗糖浓度对菌株生长的影响第34页
        3.2.6 不同氯化铵和硝酸钾浓度对菌株生长的影响第34页
    3.3 结果与讨论第34-37页
        3.3.1 菌株SK在不加氮源培养条件下的生长曲线第34-35页
        3.3.2 pH和温度对菌株SK生长的影响第35页
        3.3.3 不同氯化钠浓度对菌株SK生长的影响第35-36页
        3.3.4 不同蔗糖浓度对菌株SK生长的影响第36页
        3.3.5 不同铵浓度对菌株SK生长的影响第36-37页
    3.4 本章小结第37-39页
第4章 回接固氮菌对甘蔗生长的影响第39-45页
    4.1 实验材料第39页
        4.1.1 供试材料第39页
        4.1.2 甘蔗组织培养基第39页
        4.1.3 主要仪器第39页
        4.1.4 生化试剂第39页
    4.2 方法与步骤第39-41页
        4.2.1 固氮菌的抗性敏感性试验第39-40页
        4.2.2 三亲交配法转化少动鞘氨醇单胞菌第40页
        4.2.3 回接甘蔗组织培养苗验证第40页
        4.2.4 甘蔗根部共聚焦显微切片观察第40-41页
        4.2.5 固氮菌再分离第41页
        4.2.6 回接盆栽试验苗第41页
    4.3 结果与讨论第41-44页
        4.3.1 三亲交配法转化结果第41页
        4.3.2 少动鞘氨醇单胞菌在甘蔗根中的分布第41-43页
        4.3.3 接种固氮菌后组织培养苗的长势第43页
        4.3.4 固氮菌的再分离及其鉴定第43页
        4.3.5 接种固氮菌后盆栽苗的长势第43-44页
    4.4 本章小结第44-45页
第5章 结论第45-47页
附录第47-49页
参考文献第49-55页
读学位期间承担的科研任务与主要成果第55-57页
致谢第57-59页
个人简历第59页
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